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上课笔记|在微孔芯片上以单细胞水平分辨的人诱导多能干细胞分化为胰管样类器官
发布日期:2021-10-21浏览:

 

文章概要

文章的题目,是《Single-cell-resolved differentiation of human induced pluripotent stem cells into pancreatic duct-like organoids on a microwell chip》

 

文章发表在Nature Biomed Engineering杂志的2021年8月刊上。

 

文章的题目,翻译成中文,意思是《微孔芯片上人类诱导多能干细胞向胰管样类器官的单细胞分辨分化》

 

文章的通讯作者,是Matthias Meier,

 

他是德国慕尼黑亥姆霍兹中心的首席研究员。

 

研究背景       

 


实验结果分析

实验内容的第一部分,用人类全能干细胞,在微孔芯片上形成细胞的3D聚集体

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这是作者制作的培养类器官的芯片的外形。

 

这里,我们看到4个粉红色的培养液的液滴,每个液滴被12根小柱子围绕。

 

这个红框里,就是一个小圆柱子,12根小柱子围成一圈。

 

这些小柱子,以及芯片的底部,都被用聚二甲基硅氧烷处理过,二甲基硅氧烷是疏水的,因此,可以保证液滴被限制在小柱子中间,不流出来。

 

在每12根小柱子围绕的空间里,加入20到40微升的培养基,再在培养基中种干细胞。

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在干细胞种子种好之后,在芯片中加入800微升培养基,长期培养

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这里左边的这样图,是从芯片的底面的方向,向上看芯片中被小柱子围起来的区域。

 

我们可以看到被围起来的区域中,有许多蜂窝状排列的小圆圈。

 

这些小圆圈,每一个,都是一个小的凹坑。

 

这里的标尺,显示是一毫米的长度

 

右边的图,是芯片的纵切面的图。

 

我们可以看到纵切面上的凹坑

 

细胞就被种在这凹坑中。

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这张图是不同的小孔直径对应的细胞数。

 

在每个小孔的细胞数上,并不是越多越好,也不是越少越好

 

如果细胞数太少,则不能形成类器官;

 

但是如果细胞数多,则会影响细胞的营养供应。

 

所以,要选一个折中的细胞数量。

 

最后,作者是选择在300微米直径的孔内放600个细胞。

 

实验内容的第二部分,微孔芯片上的导管分化

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这是培养细胞的过程

 

选在芯片上,让单层培养中产生的胰腺祖细胞在芯片上形成聚集体

 

接下来,分两个阶段用各自的生长因子进行分化

 

第一个诱导阶段。均匀的圆形胰腺祖细胞聚集结构被新形成的多层上皮突起破坏

 

第二个诱导阶段,多层上皮类器官减少了层数,囊性类器官与PLDLO的外层分离

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这是细胞培养第24天到第31天的视频。

 

值得注意的是,在分化到第31天时,一些囊性PDLO结构仍与多层上皮PDLO相连。

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这是4种导管marker蛋白的表达。

 

包括:SOX9,也就是SRY-box transcription factor 9, SRY-box转录因子

 

PDX1,也就是pancreatic and duodenal homeobox 1,十二指肠同源框1

 

KRT19,也就是cytokeratin 19, 细胞角蛋白19

 

CDH1,也就是E-cadherin, E-钙蛋白

 

这四种marker蛋白的上调,证实了最后阶段细胞的上皮性质和胰腺导管特性

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确认最后阶段细胞的上皮性质和胰腺导管特性是靠下面的事实来实现的

 

通过上调 E-钙粘蛋白 (CDH1)、细胞角蛋白 19 (KRT19)、水通道蛋白 5 (AQP5)、粘蛋白 1 (MUC1) 碳酸酐酶 II (CA2)、细胞角蛋白 7 (KRT7)、密蛋白 1 (CLDN1) 和囊性纤维化 跨膜电导调节剂 (CFTR)

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已经在胰腺祖细胞阶段检测到的导管标志物的表达,例如细胞角蛋白 8 (KRT8)、SRY-box 转录因子 9 (SOX9)、肝细胞核因子 1 同源框 B (HNF1B) 以及胰腺和十二指肠同源框 1 (PDX1) 维持在 PDLOs 

 

不同的是,祖标记同源框蛋白 NKX-6.1(NKX6-1)在胰腺发育过程中变得仅限于内分泌细胞,在蛋白质水平上下调

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干性标记SRY-盒2(SOX2)和八聚体结合转录因子4(OCT4)缺席

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为了证明微孔芯片衍生的 PDLO 是谱系定向的,作者将分化至第 27 天的 PDLO 原位移植到免疫功能低下小鼠的胰腺中

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PDLO 移植物在 8 周后形成管状导管样组织,并均匀表达 SOX9、KRT19、AQP5 和 CDH1 等上皮导管标志物,并且对内分泌细胞类型呈阴性

 

实验内容的第三部分,管状类器官的单细胞表征

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为了分析微孔芯片模型中重建导管细胞类型的发育并根据转录特性定义时间分辨细胞组成,作者对14,811 个细胞进行了 scRNA-seq 分析

 

上面的A图,是用从浅到深的蓝色,来标示不同时间阶段的细胞。

 

一共是测得到14811个细胞。

 

下面的B图,是这1.4万个细胞的UMAP图。

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通过分析,确定这些细胞分成9个细胞簇。

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为了在单细胞水平上测试分化方法的稳健性,作者对两个独立实验的结束阶段进行了排序。

 

在这2种情况下。大约90%的胰腺祖细胞发育成具有导管样簇之一的转录组学特征的细胞,也就是饼图中绿色的这部分。

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小提琴图突出显示了特定于每个集群的DEG选择

 

有趣的是, 在 2D 细胞培养物中产生的起始胰腺祖细胞群包含具有不同转录谱的细胞,提示多能和单能导管祖细胞。在两个细胞簇中,都表达了共同的祖细胞标志物,包括PDX1、HNF1B和SOX9

 

实验内容的第四部分,PDLO中的导管细胞亚群

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为了在蛋白质水平上验证在单细胞转录组学中鉴定的导管样细胞类型,在微孔芯片衍生的 PDLO 上对各个簇标记进行了 IF 染色。为此,CFTR 和 MUC13 在微孔芯片上分化到第 23、27 和 31 天的 PDLO 中进行染色。

 

虽然 CFTR 仅在多层上皮 PDLO 的细胞中表达,但 MUC13 在外层的不同细胞亚群中表达多层上皮和所有囊性 PDLO 的一侧

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接下来,对 PDLO 进行了组合染色,以获得进一步的导管状亚群 DEG。事实上,发现 MUC1、CFTR、BICC1、MMP1 和 TFF1 的多层上皮 PDLO 具有不同的表达模式和荧光强度

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在健康的导管中无法检测到 MUC13、TFF1 和 SCTR

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这是对胰腺炎的样本进行染色的结果。具有MUC13、CFTR 和 SCTR的差异表达模式

 

实验内容的第五部分,体外导管发育的轨迹

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为了要解决PDLO的时间与分化的关系,作者做了RNA速率分析。

 

这是速率分析的图。

 

从UDP进化而来的导管样细胞2,它们已经存在于胰祖细胞期。

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这是对RNA速率进行基于分区的图形抽象,得到的图,也就是PAGA图, 全称叫partition-based graph abstraction图

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对细胞周期状态的评估表明,导管样细胞的成熟伴随着 G2 和 S 期细胞比例逐渐减少

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随后,作者绘制了沿潜伏时间的常见阶段特异性标记物表达的变化,以追踪导管分化。在用小鼠发展数据,胰祖细胞标记包括线GP2,翠儿家族成员1(TTYH1) ,PDX1和PTF1A随时间下降。相反,导管标志物如S100A14、CFTR、TFF1和CA2被上调

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观察到 MPP 标记的转录动力学与有丝分裂期间必需的基因(拓扑异构酶 2 (TOP2)和细胞周期蛋白 B2 (CCNB2))之间的一致性,在分化过程中均下降

 

实验内容的第六部分,CFTR+/mucin+ 的亚细胞群在原始导管组织中

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对微孔芯片衍生的 PDLO 的需求之一是导管样细胞类型能够密切反映人体组织

 

因此,作者从3个原代人类胰腺组织的单细胞RNA测序的数据集到到PDLO的分化动力学

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在重新聚类的组合数据集中,来自 PDLO 的导管状聚类与初级导管细胞映射。来自体外分化轨迹的导管祖细胞以及内分泌、腺泡和内皮细胞分别聚集在一起。初始细胞类型分配与组合数据集中的簇位置的比较进一步证实了整合方法

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此外,作者计算了来自 Baron 等人的主要CFTR 和MUC1 导管亚群的前 100 个 DEG 的基因表达富集分数。跨 PDLO 分化动力学。事实上,CFTR 和MUC13  PDLO 细胞再次与相应的初级导管亚群相关

 

实验内容的第七部分,微孔芯片的应用

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微孔芯片可用于各种应用。一个例子是研究胰管和各种基质细胞之间的细胞间通讯

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PDLOs 和 HPaSteCs 的定量蛋白质组分析将共培养的细胞与其单独培养的对应物分开

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实验内容的第八部分,细丝蛋白b在人胰腺癌队列中的表达

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胰腺癌变过程中调查FLNB表达 ,我们在切除的PDAC组织中,通过切免疫染色评估FLNB蛋白表达

 

FLNB 在不同的癌症中发挥组织和环境相关的功能,而功能的获得和丧失都已被证明会促进癌症特性。

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胰腺上皮内瘤变 (PanIN) 代表最相关的胰腺导管腺癌前体病变,并且经常在胰腺导管腺癌附近发现,并且它们的存在具有预后相关性。有趣的是,与正常导管相比,PanIN 中的 H 分数也升高

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PanIN 病灶中 FLNB 的表达与患者的较高存活率显着相关(mOS;p=0.0019)

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有趣的是,与分化程度较低的肿瘤(≥G3)或健  康供体相比,分化的肿瘤(≤G2)具有显着更高的 FLNB PB 水平,后两者具有或多或少相似的水平

 

总结

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